2 БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

 

---

История развития представлений о механизмах реакций

2.1 Классификация процессов биологического окисления

2.1.1 Свободное окисление

2.1.2 Субстратное фосфорилирование

2.1.3 Митохондрии как внутриклеточные центры аэробного дыхания

2.1.4 Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепь

2.1.5 Механизм сопряжения дыхания с фосфорилированием АДФ

2.1.6 Дыхательный контроль и нарушение клеточного дыхания

---

Биологическое окисление, или тканевое дыхание, представляет собой совокупность окислительно-восстановительных процессов, протекающих в живых клетках, основной функцией которого является обеспечение организма энергией в доступном для использования виде и восстановительными эквивалентами для биосинтетических процессов.

Функции этого важнейшего биологического явления даже несколько шире, чем это отмечено в приведенном выше определении, т.к. при посредстве реакций биологического окисления разрушаются также вредные продукты обмена веществ и проникшие в организм чуждые соединения. Более того, состояние окислительно-восстановительных процессов в клетках сказывается на регуляции обмена веществ в них.

Разнообразные реакции биологического окисления ускоряются многочисленными ферментами, относящимися к классу оксидоредуктаз. Эти ферменты, как правило, встроены в биологические мембраны, причем очень часто в виде ансамблей.

История развития представлений о механизмах реакций биологического окисления

В XVIII столетии А. Лавуазье установил, что процесс дыхания связан с окислением веществ, и обратил внимание на сходство процессов горения органических веществ и дыхания животных, в связи с чем в науке долгое время господствовало мнение, что биологическое окисление представляет собой медленное горение.

Принципиальной особенностью биологического окисления в отличие от горения является то, что окислительные процессы в организме протекают при низкой температуре без резких перепадов и без появления пламени, т.к. энергия выделяется не одновременно, а порционно (частями).

Вторая особенность состоит в том, что при биологическом окислении вода является не только конечным продуктом, как при горении, но непосредственным участником окислительных процессов, которые более интенсивно протекают в тканях с высоким содержанием воды.

Третьей особенностью биологического окисления является то, что реакцией, поставляющей энергию в живых организмах, за незначительным исключением, является реакция окисления водорода кислородом, которая в обычных условиях протекает со взрывом.

В целях объяснения особенностей биологического окисления было выдвинуто несколько теорий. Первая попытка выявить молекулярный механизм биологического окисления была предпринята лишь в следующем столетии Хр. Ф. Шёнбайном (1845–1868). Им была выдвинута идея о том, что необходимым условием протекания биологических окислительных процессов является активирование кислорода. Естественно, что конкретные пути этого активирования выглядели фантастически (предполагалось существование отрицательно-активной формы кислорода, тождественной озону и положительно-активной, названной антиозоном), но сама идея была плодотворна. Хр. Ф. Шёнбайн впервые высказал мысль о том, что биологическое окисление есть каталитический процесс. Ему же удалось экспериментально доказать образование Н₂О₂ при биологическом окислении.

На рубеже XIX и XX вв. наш соотечественник А. Н. Бах и независимо от него в Германии К. Энглер и В. Вилд выдвинули гипотезу об образовании пероксидов органических соединений как первом этапе биологического окисления. При этом молекула кислорода переводилась в активированное состояние за счет разрыва двойной связи в ней при посредстве «внутренней колебательной энергии» самого окисляемого соединения, обладающего кратной связью, и при участии ферментов – оксидаз в соответствии с такой, например, схемой:

 

Возникшие пероксиды органических соединений, как и пероксид водорода, могут окислять другие вещества при каталитическом воздействии пероксидазы – фермента, достаточно в то время уже изученного:

 

Пероксид водорода может распадаться и иным путем, при участии фермента каталазы, о котором в этот период тоже накопилось довольно много сведений:

 

Принципиально иной подход к расшифровке механизмов реакции биологического окисления был намечен в трудах В. И. Палладина, а вслед за ним – Г. Виланда. На основании опытов с дыхательными хромогенами (под ними он подразумевал бесцветные вещества растительного происхождения, способные в присутствии оксидаз присоединять кислород и переходить при этом в пигменты, которые в свою очередь могли передавать присоединенный кислород окисляемому субстрату, одновременно обесцвечиваясь) В. И. Палладии впервые (1912) высказал идею о том, что биологическое окисление есть перенос водорода от окисляемого вещества навстречу кислороду с образованием воды в качестве конечного продукта. На основании проведенных им исследований было доказано, что дыхательные хромогены являются не переносчиками кислорода, а акцепторами водорода.

Концепция В. И. Палладина довольно быстро получила подтверждение. Благодаря трудам Т. Тунберга, Д. Самнера, Г. Сомерса, В. Мак-Шена и др. были выделены и охарактеризованы разнообразные дегидрогеназы, ускоряющие реакции окисления тех или иных субстратов при участии коферментов, являющихся акцепторами снимаемых с них атомов водорода.

Таким образом, в начале нашего столетия сложились две концепции биологического окисления: активирования кислорода и активирования водорода. Их противоборство продолжалось недолго: в 1925 г. Д. Кейлин в тканях ряда насекомых, а затем и в других аэробных биологических объектах открыл цитохромы – те недостающие ферменты, которые позволили несколькими годами позже связать активирование кислорода и водорода воедино. Этому способствовало обнаружение О. Варбургом (1928) цитохромоксидазы, получившей в то время наименование «дыхательного фермента Варбурга». Именно цитохромоксидаза оказалась тем ферментом, который непосредственно активирует кислород, а цитохромы – ферментами, снимающими электроны с водорода и передающими их цитохромоксидазе. Так впервые возникло представление об ансамблях ферментов дыхательной цепи, обеспечивающих реакции биологического окисления. В частности, оксидоредуктазная цепь, главной составной частью которой являются цитохромы, получила название цитохромной системы:

 

Ферменты, находящиеся в конце таких оксидоредуктазных цепей и непосредственно переносящие электроны на кислород, получили название терминальных оксидаз.

Таким образом, открытие цитохромов (Д. Кейлин, 1925) и фермента цитохромоксидазы (О. Варбург, 1928) позволило создать современную теорию биологического окисления (или тканевого дыхания), получившую название дыхательной цепи транспорта электронов.

Стадии биологического окисления. У аэробно дышащих клеток конечным акцептором электронов и протонов является кислород. В этой связи биологическое окисление в аэробных клетках проходит три основные стадии:

Образование ацетил-КоА. Эта стадия состоит из различных путей метаболизма углеводов, липидов, аминокислот, отличающихся своими механизмами от субстрата к субстрату.

Окисление ацетил-КоА в цикле трикарбоновых кислот с образованием восстановленных коферментов (НАДН, ФАДH₂) и выделением СО₂.

Окисление водорода восстановленных коферментов в дыхательной цепи транспорта электронов, сопряженной с окислительным фосфорилиро-ванием. В результате сопряжения окисления и фосфорилирования значительная часть энергии аккумулируется в макроэргических (высокоэнергетических) соединениях.

2.1 Классификация процессов биологического окисления и их локализация в клетке

Существуют 2 типа биологического окисления:

1. Свободное окисление.

Окисление, не сопряженное с фосфорилированием АДФ и не сопровождающееся трансформацией энергии, выделяющейся при окислении, в энергию макроэргических связей. При свободном окислении высвобождающаяся энергия переходит в тепловую и рассеивается.

По типу свободного окисления идут все без исключения окигеназные реакции, все окислительные реакции, ускоряемые пероксидазами и сопровождающиеся образованием Н₂О₂, многие реакции, катализируемые оксидазами.

Процессы свободного окисления сосредоточены в цитозоле, в мембранах эндоплазматической сети клетки, в мембранах лизосом, пероксисом и аппарата Гольджи, на внешних мембранах митохондрий и хлоропластов. Они идут также в ядерном аппарате клетки.

2. Окисление, сопряженное с фосфорилированием АДФ.

Этот тип биологического окисления осуществляется тремя путями:

а) субстратное фосфорилирование;

б) окислительное фосфорилирование (сопряжение на уровне электро-нотранспортной цепи);

в) фотосинтетическое фосфорилирование – процесс, в котором фотосинтетические организмы улавливают солнечную энергию, главный сточник энергии для биосферы Земли, и направляют ее на синтез АТФ.

Большинство организмов синтезируют необходимый им АТФ в основном именно в процессах окислительного фосфорилирования и фотофосфорилирования. В эукариотических клетках окислительное фосфорилирование протекает в митохондриях, фотофосфорилирование – в хлоропластах.

2.1.1 Свободное окисление

Реакции свободного окисления органических соединений в живой природе и ускоряющие их ферментные системы многообразны. Этим путем непосредственно окисляются не только многочисленные природные и неприродные субстраты, но и восстановленные коферменты (НАДН, НАДФН, ФАДН₂ и др.), образовавшиеся при действии первичных и вторичных дегидрогеназ.

Реакции свободного окисления протекают в цитозоле, на мембранах различных субклеточных структур, в ядерном аппарате клетки. Основным средоточием их являются мембраны эндоплазматической сети (ЭПС).

Так как мембраны ЭПС при гомогенизации клеток и фракционировании субклеточных частиц гомогената дают фракцию микросом, то реакции окисления на мембранах ЭПС называются микросомальным окислением.

 

Особенности микросомальной дыхательной цепи

1. Микросомальная цепь ферментов содержит цитохром Р₄₅₀, специфический флавопротеин, включающий ФАД, и Fe-белок, содержащий негеминовое железо. Флавопротеины и цитохромы, которые функционируют в микросомальной цепи окисления, резко отличаются от ферментов митохондриальной дыхательной цепи.

В микросомальной дыхательной цепи имеются две точки цепи, где участвует НАДФН: первый раз он поставляет атом водорода и протон для образования воды, второй – отдает электрон для восстановления цитохрома Р₄₅₀ (в переносе электрона на цитохром участвуют флавопротеин и белок, содержащий негеминовое железо). Считается, что цитохром Р₄₅₀ выполняет двоякую функцию. Во-первых, он связывает субстрат гидроксилирования, во-вторых, на нем происходит активация молекулярного кислорода.

2. Своеобразие структуры и функциональной активности цитохромов b₅ и Р₄₅₀, входящих в ее состав.

3. Высокое сродство терминальной оксидазы микросомальных цепей к кислороду, позволяющее ей конкурировать за кислород с митохондриальной цитохромоксидазой.

Окисление органических соединений в микросомальных реакциях, в отличие от реакций митохондриального окисления, как правило, не решает энергетических задач, а выполняет защитную (детоксикационную) и пластическую функции.

Свободное окисление при участии диоксигеназ. Одной из наиболее изученных диоксигеназ является пирокатехаза (катехол: кислород-1,2- оксидоредуктаза дециклизующая); ее М = 85 000 Да. Концентрированные растворы пирокатехазы красного цвета, т.к. она содержит в активном центре два прочно связанных атома Fe, которые, согласно О. Хайаиши, соединяются с молекулярным кислородом в комплекс, где кислород далее активируется:

 

Далее в активном центре пирокатехазы после присоединения субстрата возникает тройной комплекс, преобразование которого приводит к включению молекулярного кислорода в пирокатехин:

 

Одной из биологически важных диоксигеназных реакций является превращение β-каротина в витамин А:

 

Свободное окисление при участии монооксигеназ. Монооксигеназы характеризуются молекулярными массами от 65 000 до 200 000, отсутствием, как правило, в их составе ионов тяжелых металлов и наличием коферментов флавиновой природы. Кроме того, многие из них требуют участия в реакции монооксигенирования так называемого парного донора, от которого поступают атомы водорода на один из атомов молекулярного кислорода (второй внедряется в окисляемый субстрат).

Простейший представитель монооксигеназ – фенолгидроксилаза (фенол-2-монооксигеназа):

 

Монооксигеназы принимают большое участие в окислении аминокислот (лизин-, аргинин- и триптофанмонооксигеназы, фенилаланин- и тирозингидроксилаза), оксикислот (салицилатгидроксилаза), полиизо- преноидных соединений (сквален-эпоксидаза).

Механизм действия монооксигеназ выяснен недостаточно. Предполагают, что активной формой кислорода может быть связанный с ферментом пероксид водорода или его эквивалент.

Пероксидазный путь заключается в переносе двух атомов водорода на одну молекулу кислорода. Его можно представить в виде схемы:

RH₂ + O₂ → R + H₂O₂.

Энергия окисления выделяется в виде тепла. Это простые окислительные системы, представленные ФМН и ФАД-содержащими ферментами, а также металлопротеинами. Они более широко распространены в растительных клетках, чем в клетках животных и человека. В клетке около 80 % этих ферментов сосредоточено в пероксисомах. Кроме того, они встречаются в мембранах, граничащих с цитозолем. Так происходит окисление альдегидов, аминов, L- и D-аминокислот, пуринов и др. Некоторые из названных веществ являются токсическими. В лейкоцитах, гистиоцитах и других клетках, способ¬ных к фагоцитозу, пероксидазный путь окисления субстратов очень активен. Образующаяся Н₂O₂ используется для обезвреживания болезнетворных бактерий и распада инфекционного материала, поглощенного клетками. Однако избыточное накопление перекиси водорода токсично, особенно для нефагоцитирующих клеток. Накопление пероксидов и генерация свободных радикалов может приводить к повреждению мембран (рак, атеросклероз).

Для предотвращения повреждающего действия пероксидов служат две ферментативные системы. Первая – фермент пероксидаза, простетической группой которой является протогем. Ферменты этого типа широко представлены у растений, а также встречаются в молоке, лейкоцитах, тромбоцитах и тканях, продуцирующих эйкозаноиды:

Н₂О₂ + RH₂ → 2Н₂О + R,

где RH₂ – аскорбиновая кислота, хиноны, цитохром С, глутатион.

В эритроцитах и некоторых других тканях присутствует глутатионпероксидаза, содержащая Se в качестве простетической группы. Этот фермент защищает мембраны и гемоглобин от окисления пероксидами.

Второй фермент – каталаза, являющийся гемопротеином (4 гема). Функция этого фермента – разрушение токсичного пероксида водорода, образующегося в ходе различных окислительных процессов в организме:

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂.

Специфичность каталазы в отношении к субстрату-восстановителю невелика, поэтому она может катализировать не только разложение H₂O₂, но и окисление низших спиртов. Каталаза содержится в крови, костном мозге, слизистых оболочках, печени, почках, т. е. в клетках, где происходит интенсивное окисление с образованием Н₂О₂.

Свободнорадикальное окисление. Под свободными радикалами понимают молекулу или ее часть, имеющую неспаренный электрон на молекулярной или на внешней атомной орбите. Появление неспаренного электрона – реализация у молекулы свободной валентности. Свободные радикалы реакционноактивны и вступают в химические реакции для приобретения недостающего электрона.

Полное восстановление О₂ до Н₂О требует присоединения 4 электронов:

О₂ + 4е⁻ + 4Н⁺ → 2Н₂О.

При неполном восстановлении (т. с. присоединении 1, 2 или 3е⁻) образуются свободно-радикальные формы кислорода: супероксидный анион-радикал (^•О₂⁻ ), гидроксильный радикал (^•ОН), гидропероксильный радикал (^•О₂Н), а также синглетный кислород (¹О₂), которые являются мощными окислителями, накопление которых чрезвычайно токсично для живых организмов.

Следует помнить, что все приведенные выше радикалы крайне реакционноспособны и вступают в какую-нибудь другую реакцию окисления, порождая очередной радикал. Таким образом, процесс носит цепной характер и потенциально может продолжаться бесконечно.

Супероксидный радикал принимает участие в процессах повреждения биологических структур (инициации перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран, повреждении молекул ДНК, окислении SH-групп белков, инактивации ферментов, деполимеризации полисахаридов). Однако непосредственный повреждающий эффект в большинстве случаев обусловлен, по-видимому, значительно более активными гидроксильным радикалом и синглентным кислородом, образующимися при взаимодействии ^•О₂^¯ с Н₂О₂ в ходе реакции Габера–Вейса:

^•О₂^¯ + Н₂О₂ → ¹О₂ + ^•ОН + OH‾,

где ^•О₂^¯ – супероксидный радикал,

Н₂О₂ – перекись водорода,

¹О₂ – синглетный кислород,

^•ОН – гидроксильный радикал.

Гидроксил-радикал инициирует ПОЛ, которое протекает по свободнорадикальному цепному механизму и схематически может быть изображено следующим образом:

^•ОН + RH → R^• + OH‾ + H⁺

R^• + О₂ → RO₂^•

RO₂^• + RH → ROOH + R^•,

где ^•ОН – гидроксильный радикал,

RH – НЖК,

R^• – радикал НЖК,

RO₂^• – перекисный радикал,

ROOH – липидная гидроперекись.

Избыточное окисление липидов приводит к разрушению биологических мембран, что является наиболее вероятной причиной необратимых нарушений в клетке, приводящих к её биологической гибели. Весьма опасным является свободнорадикальное окисление (СРО) мембранных липидов лизосом, где действуют десятки ферментов, которые катализируют процессы превращения белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот. В результате нарушения целостности мембран лизосом ферменты получают свободный доступ в цитоплазму и разлагают названные биомолекулы.

Антиоксидантная защита. В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем, ферментативных и неферментативных систем клетки, отчего скорость его невелика.

Химические соединения, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, делят на:

прооксиданты (усиливают процессы свободно радикального окисления);

антиоксиданты (тормозят свободнорадикальное окисление (СРО)).

К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.

Антиоксиданты (АО) – это соединения различной химической природы, способные ингибировать или блокировать реакции окисления органических веществ свободными радикалами (рисунок 4).

В наиболее общем виде под АО понимаются вещества, которые содержат подвижный атом водорода с ослабленной связью с углеродом, которые вступают в реакцию с окислительными свободными радикалами и, тем самым, уменьшают их концентрацию в реакционной среде.

АО прямого действия взаимодействуют непосредственно со свободными радикалами, в результате чего активный радикал, ведущий цепь окисления, заменяется на малоактивный радикал ингибитора, что ускоряет обрыв цепи:

InH + R^• → In^• + RH

InH + RO₂^• → In^• + ROOH

InH + RO₂^• → InO₂^• + RH,

где InH – антиоксидант,

R^• – радикал,

RO₂^• – перекисный радикал,

In^•, InO₂^• – малоактивные радикалы.

 

Защитный эффект АО усиливается, если его свободные радикалы будут реагировать с перекисными соединениями и между собой, образуя химически инертные вещества:

_In^• _{+ RO2}^• _{→ InRO2}

In^• + In^• → In₂

В качестве примера АО непрямого действия можно привести белки-хелаторы (рисунок 4), связывающие ионы переменной валентности (Fe, Cu и др.), которые, в свою очередь, являются катализаторами свободно-радикальных процессов. Другие АО из этой группы устраняют токсичные продукты СРО, восстанавливают структуру АО прямого действия (например, глутатионредуктаза), ингибируют ферментные системы, ответственные за генерацию свободных радикалов.

В процессе этих реакций АО расходуются. При достаточном количестве АО происходит полная замена свободных радикалов цепи на стабильные, и процесс окисления останавливается, а в присутствии меньшего количества АО процесс замедляется, но продолжает оставаться самоускоряющимся. Таким образом, АО регулируют нормальную деятельность организма человека, защищая биомолекулы клетки (липиды, ферменты, белки и нуклеиновые кислоты) от окислительного повреждения.

Одним из мощных антиоксидантов животных (в том числе и человека), растений и микроорганизмов является глутатион. Глутатион по химической природе – это трипептид (γ-глутамилцистеинилглицин):

 

Особенностью химической структуры глутатиона является пептидная связь между аминогруппой цистеина и карбоксильной группой радикала глутамата.

Внутриклеточная концентрация глутатиона составляет 0,5–10 мМ, что существенно выше концентрации свободного цистеина. Его биологическая роль заключается в следующем:

– защищает SH-группы ферментов и др. белков от окисления;

– восстанавливает Н₂О₂ и другие пероксиды;

– связывает свободные радикалы;

– участвует в тиол-дисульфидном обмене и в обезвреживании ксенобиотиков;

– восстанавливает рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды;

– переносит аминокислоты через мембрану клеток (глутамилтрансфераза);

– является кофактором некоторых ферментов (глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназы).

2.1.2 Субстратное фосфорилирование

Если макроэргическая связь возникает в момент непосредственного окисления субстрата, а затем тем или иным путем передается на фосфатный остаток, который в свою очередь используется для фосфорилирования АДФ, т.е. синтеза АТФ, то такой вид биологического окисления называют окислением, сопряженным с фосфорилированием АДФ на уровне субстрата. Субстратное фосфорилирование сосредоточено в растворимой части клетки.

Примерами сопряжения окисления с фосфорилированием на уровне субстрата могут служить реакции окисления фосфоглицеринового альдегида в 3-фосфоглицериновую кислоту, 2-фосфоенолпировиноградной кислоты – в пировиноградную кислоту, α-оксоглутаровой кислоты – в янтарную кислоту (здесь фосфорилируется ГДФ).

Образовавшийся ГТФ может отдавать свою концевую фосфорильную группу АДФ, в результате чего образуется АТФ:

ГТФ + АДФ ↔ ГДФ + АТФ

Однако посредством реакций субстратного фосфорилирования образуется небольшое количество АТФ.

2.1.3 Митохондрии как внутриклеточные центры аэробного дыхания

Митохондрии – это особые органеллы клетки, внутриклеточные центры аэробного дыхания, «энергетические станции» клетки. Они обнаружены во всех клетках животных и растений, за исключением эритроцитов. Митохондрии, как правило, представляют собой овальные тельца размером примерно 0,5×3 мкм. Форма митохондрий в разных клетках различна – от нитей до палочек, петель и сфер.

В клетке в зависимости от ее типа и функции может находиться от нескольких десятков до нескольких тысяч митохондрий. Во многих клетках митохондрии распределены довольно равномерно, однако наблюдается тенденция к локализации их в наиболее активных зонах клетки. В некоторых тканях митохондрии выстраиваются таким образом, чтобы облегчить доставку АТФ к структурам, использующим энергию.

Структура митохондрий изучена методом электронной микроскопии. В митохондриях различают две мембраны – наружную и внутреннюю, внутреннее пространство и межмембранное пространство. Внутреннее пространство заполнено так называемым матриксом – гелеобразной полужидкой массой. Внутренняя мембрана образует выпячивания, или кристы (рисунок 5).

Митохондриальные мембраны представляют собой липопротеиновые структуры толщиной 5–7 нм. Наружная мембрана гладкая, хорошо проницаема для веществ, имеющих молекулярную массу менее 10 000. Для нее характерно высокое отношение количества фосфолипидов к белкам (примерно 1:1). В наружной мембране содержится ряд ферментов, участвующих в удлинении молекул насыщенных жирных кислот, а также белки, катализирующие окисление, не связанное с синтезом АТФ. Набор ферментов наружной мембраны различается в митохондриях разных организмов.

Внутренняя мембрана митохондрий покрыта со стороны матрикса грибовидными выростами, или «элементарными тельцами», которые в основном являются АТФазой. Внутренняя мембрана непроницаема для большинства веществ, а также для Н⁺ и ОН ˉ. Проникают только О₂ и нейтральные молекулы с молекулярной массой меньше 150. Отношение фосфолипидов к белкам низкое, примерно 1 : 3. Внутренняя мембрана во всех клетках выполняет одинаковую функцию – сопряжение окисления с синтезом АТФ, т.е. является сопрягающей мембраной. Она содержит ферменты электрон-транспортной цепи и синтеза АТФ.

В межмембранном пространстве митохондрий найдены ферменты аденилаткиназа и нуклеозид-дифосфат-киназа. Матрикс митохондрии содержит систему β-окисления жирных кислот и ферменты цикла трикарбоновых кислот.

2.1.4 Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепь

В 1930 г. В. А. Энгельгардт установил, что аккумулирование энергии в АТФ сопряжено с окислительным фосфорилированием. Если атомы водорода с коферментов дегидрогеназ, принимающих участие в окислении субстратов, передаются в оксидоредуктазную цепь (дыхательную цепь), где сопряженно с переносом протонов и электронов на молекулярный кислород происходит активирование неорганического фосфата и при его посредстве фосфорилирование АДФ с образованием АТФ, то такое сопряжение окисления с синтезом АТФ называют сопряжением на уровне электрон-транспортной цепи. Ранее этот вид биологического окисления называли окислительным фосфорилированием и отождествляли с дыханием. А. Ленинджер (1949) показал, что этот процесс происходит в митохондриях, а в 60-х гг. было установлено, что ферменты окислительного фосфорилирования локализованы на внутренней мембране митохондрий. Именно здесь осуществляется сопряжение окисления с фосфорилированием на уровне электрон-транспортной цепи.

У аэробных организмов этот механизм является главным в биосинтезе АТФ. Окислительное фосфорилирование можно представить в виде схемы:

Атомы водорода, снятые с субстратов в цикле Кребса, при β-окислении высших жирных кислот, при пируватдегидрогеназной, глутаматдегидро-геназной и некоторых других реакциях, поступают в дыхательную цепь ферментов внутренней мембраны митохондрий (рисунок 5).

Дыхательную цепь нередко называют редокс-цепью, что в переводе означает окислительно-восстановительная цепь, поскольку в ней многократно протекают процессы окисления – восстановления. Ее называют также цепью переноса электронов, электрон-транспортной цепью (ЭТЦ) или электронпереносящей цепью (ЦПЭ).

Компоненты электрон-транспортной цепи, осуществляющие перенос электронов и окислительное фосфорилирование, слиты в единое целое с внутренней мембраной митохондрий и функционируют в форме полиферментативных комплексов или ансамблей. Одну полную цепь переноса электронов составляет большое число молекул. Так, в митохондриях, полученных из сердца быка, цепь переноса электронов состоит примерно из 80 белковых молекул. Только ¹/₃ из них – непосредственные переносчики электронов, остальные ²/₃ – белки, выполняющие вспомогательные функции.

В ЭТЦ формируется трансмембранный электрохимический потенциал посредством переноса электрона по цепи, сопряженного с перекачкой протонов через мембрану.

Чанс и др. (США) в 50-х гг. XX века разместили компоненты ЭТЦ, используя окислительно восстановительный потенциал переносчиков электронов (I – вспомогательные ферменты (активируют субстрат); II – дегидрогеназы; III – промежуточные ферменты; IV – оксидазы).

Д. Грин в 1961 году все переносчики электронов в митохондриальной мембране сгруппировал в четыре надмолекулярных комплекса:

1. Комплекс I – НАДН-дегидрогеназный – осуществляет прием электронов от НАДН (в отдельных случаях – от ФАДН₂) и передачу их убихинону (коферменту Q).
2. Комплекс II – сукцинатдегидрогеназный – осуществляет перенос электронов от сукцината. Является интегральным белком, связанным с внутренней мембраной митохондрий, и окисляет сукцинат (янтарную кислоту из ЦТК).
3. Комплекс III – КoQ-цитохром с-редуктазный – переносит электроны от убихинона к цитохрому с.
4. Комплекс IV – цитохром с-оксидазный – переносит электроны от цитохрома с на молекулярный кислород как конечный акцептор.

Общую схему движения электронов и протонов через четыре комплекса ЭТЦ можно представить следующим образом (рисунок 6).

Универсальным донором атомов водорода для ЭТЦ служит НАДН. Если при окислении субстрата возникает НАДФН, то он обычно используется как восстановитель в процессах биосинтеза. Однако может протекать трансгидрогеназная реакция, посредством которой атомы водорода передаются от НАДФН на НАД⁺, после чего поступают в электрон-транспортную цепь:

Другим первичным источником атомов водорода и электронов в ЭТЦ служит восстановленный флавопротеин, если он выполняет роль первичной дегидрогеназы, как, например, в случае окисления янтарной кислоты в цикле трикарбоновых и дикарбоновых кислот. Флавопротеин, но несколько иной природы, служит передаточной инстанцией для атомов водорода и электронов от НАДН к убихинонпротеину электрон-транспортной цепи.

На рисунке 7 представлена электрон-транспортная цепь митохондриальной мембраны. Она открывается НАДН, с которого атомы Н передаются на первый белковый компонент ЭТЦ – флавопротеин, несущий флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве кофермента, а восстановленный ФАД всегда передает водороды на кофермент Q.

После кофермента Q по системе цитохромов осуществляется транспорт только электронов; роль конечного – терминального – акцептора электронов выполняет кислород.

Все компоненты электрон-транспортной цепи располагаются в порядке возрастания их окислительно-восстановительных потенциалов (Е₀׳), что обеспечивает упорядоченную передачу атомов водорода и электронов по такой редокс-цепи. Особенностью ЭТЦ ферментов является наличие в ней участков, где соседние компоненты резко отличаются значениями окислительно-восстановительных потенциалов (ΔЕ₀). Именно здесь происходит сопряжение окисления с фосфорилированием АДФ. В ЭТЦ содержится три участка, в которых перенос электронов сопровождается большим изменением разности потенциалов (свободной энергии). Уменьшение свободной энергии в каждом из этих участков достаточно велико для того, чтобы обеспечить образование АТФ из АДФ и Н₃РО₄. Именно в этих участках ЭТЦ осуществляется запасание энергии в фосфатных связях АТФ (рисунок 8).

Для количественного выражения окислительного фосфорилирования введен коэффициент окислительного фосфорилирования – Р/О. Он был предложен в 1939 г. советским ученым В. А. Белицером как мера эффективности окислительного фосфорилирования.

Коэффициент Р/О – это отношение числа молекул неорганического фосфата, перешедших в состав АТФ в процессе дыхания, на каждый поглощенный атом кислорода.

К настоящему времени коэффициенты P/О определены для окисления митохондриями ряда субстратов. В начальных исследованиях этот коэффициент P/О при окислении НАДH был равен 3, а при окислении ФАДН₂ – 2. В процессе совершенствования методических подходов эти величины были уточнены (при окислении НАДH P/О=2,5, при окислении ФАДН₂ – P/О=1,5).

Таким образом, в результате исследований были установлены участки сопряжения в дыхательной цепи: они соответствуют участкам, где перенос электронов сопровождается большим изменением разности потенциалов: первый – между НАДН и флавопротеином, второй – между цитохромом b и цитохромом с₁, третий – на участке цитохромоксидазы. Таким образом, дыхательная цепь разделяет энергию, выделяющуюся при переносе электронов, на отдельные «порции». В трех случаях они превышают 34,5 кДж·моль^-1, необходимые для генерирования АТФ из АДФ и фосфата. Все компоненты электронотранспортной цепи являются ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные процессы.

Флавопротеин является первым ферментом, акцептирующим протоны и электроны от первичной дегидрогеназы – фермента, снимающего атомы водорода непосредственно с субстрата. Коферментом флавопротеина является ФМН. Этот фермент тесно связан с железосерными белками.

Железосерные белки имеют небольшую молекулярную массу (порядка 10 кДа). Они содержат негеминовое железо, связанное с атомами серы остатков цистеина (рисунок 9).

Эти белки участвуют в переносе протонов и электронов и, как предполагают, на нескольких стадиях. Однако до сих пор не ясен механизм, по которому железосерные белки претерпевают обратимое окисление-восстановление.

Кофермент Q, или убихинон, растворен в липидной части внутренней мембраны митохондрий. Убихинон может диффундировать как поперек, так и вдоль мембраны. Он является единственным, не связанным с белками компонентом цепи дыхания; по этой причине его нельзя отнести к ферментам. Кофермент Q принимает два протона водорода и два электрона от железосерных белков, превращаясь в гидрохинон.

Восстановленный кофермент Q далее «выбрасывает» протоны водорода в матрикс, а по цепи дыхания транспортируются только электроны. Транспорт электронов осуществляют цитохромы.

Цитохромы представляют собой гемопротеины. В настоящее время известно около 30 различных цитохромов. Все они, в зависимости от своей способности поглощать свет, разделяются на классы, обозначаемые строчными буквами – α, b, с и т.д. Внутри каждого класса выделяют отдельные виды цитохромов, обозначая их цифровыми индексами – b, b₁, b₂ и т.д.

Цитохромы отличаются друг от друга структурой гема, структурой полипептидной цепи и способом прикрепления гема к ней. На рисунке 10 показана структура гема, входящего в состав всех цитохромов b.

Цитохромы окрашены в красно-коричневый цвет; окраска обусловлена наличием катиона металла. Цитохромы классов b и c содержат в своем составе катионы железа, а цитохромы класса α – катионы меди.

Цитохромы α и α₃ образуют комплекс, который называют цитохромоксидазой. Уникальная особенность комплекса α·α₃ заключается в том, что эта система цитохромов передает электроны непосредственно на кислород.

Перенос электронов по цепи цитохромов включает обратимые реакции:

Fe³⁺ + ē ↔ Fe²⁺ и Cu²⁺ + ē ↔ Cu⁺

2.1.5 Механизм сопряжения дыхания с фосфорилированием АДФ

Известны три основных гипотезы окислительного фосфорилирования:

1. Механохимическая, или конформационная (Грин, П. Бойер, 60-е гг. XX в.). В процессе переноса протонов и электронов изменяется конформация белков-ферментов. Они переходят в новое богатое энергией состояние, а затем при возвращении в исходную конформацию отдают энергию для синтеза АТФ. Гипотеза частично подтверждена:

Е_{окислен} → Е_{конформ. сдвигов} → Е_АТФ

2. Гипотеза химического сопряжения (Ф.А. Липман, Е. Слейтер, А. Ленинджер, 30–40-е гг. XX в.). В сопряжении дыхания и фосфорилирования участвуют сопрягающие вещества, например, вещество X. Вещество «X» акцептирует протоны и электроны от первого фермента в пункте сопряжения, и взаимодействует с Н₃РО₄. В момент отдачи протонов и электронов второму ферменту пункта сопряжения связь становится макроэргической. Далее макроэрг передается на АДФ с образованием АТФ. До настоящего времени не выделены сопрягающие вещества.

3. Хемиосмотическая гипотеза (П. Митчелл). Теория П. Митчелла была развита в работах В. П. Скулачева.

Согласно хемиосмотической гипотезе энергия переноса протонов и электронов вдоль дыхательной цепи первоначально сосредоточивается в виде протонного потенциала, создающегося движением через мембрану заряженных протонов водорода. Транспорт протонов обратно через мембрану сопряжен с фосфорилированием АДФ, которое осуществляется протонзависимой АТФ-синтазой.

Поскольку движущей силой синтеза АТФ является протонный потенциал, подробнее рассмотрим его образование.

Наряду с переносом протонов и электронов по цепи дыхания осуществляется дополнительный выброс протонов водорода из матрикса в межмембранное пространство. Протоны водорода возникают при диссоциации воды в матриксе:

H₂O ↔ H⁺ + OH^ˉ

Перенос протонов водорода через внутреннюю мембрану митохондрий, как предполагают, осуществляется протонными транслоказами.

В результате функционирования электрон-транспортной цепи происходит перенос в межмембранное пространство 10 протонов водорода на каждые транспортируемые 2 электрона. Так при поступлении на кислород пары электронов комплекс I выкачивает из матрикса четыре протона, комплекс III – четыре Н⁺ и комплекс IV – два Н⁺ (рисунок 11).

В результате такого переноса мембрана со стороны матрикса заряжается отрицательно (за счет оставшихся отрицательно заряженных гидроксилов), а со стороны межмембранного пространства – положительно (за счет перекачки положительно заряженных протонов водорода) (рисунок 11).

В результате такого распределения зарядов возникает электрический потенциал, обозначаемый Δψ (дельта пси). А за счет возникшей разницы в концентрации протонов водорода по обе стороны внутренней мембраны митохондрий создается химический градиент протонов, обозначаемый ΔрН. Оба возникших потенциала создают на мембране электрохимический трансмембранный градиент протонов (ΔµН⁺), следовательно ΔµН⁺ = Δψ + ΔрН.

Синтез АТФ. Мембрана, на которой создается электрохимический трансмембранный градиент протонов, называется энергезированной. Энергизированная мембрана стремится разрядиться за счет перекачки протонов из межмембранного пространства обратно в матрикс (рисунок 11). Этот процесс осуществляется с помощью протонзависимой АТФазы.

В составе энергезированной митохондриальной мембраны функция протонной АТФазы сводится к транспорту протонов внутрь митохондрии, к снятию электрохимического градиента Н⁺ и к синтезу (сопряженно с переносом Н⁺ с внешней стороны сопрягающей мембраны на ее внутреннюю сторону) АТФ. Поэтому ее называют также АТФ-синтазой, что подчеркивает ее истинную функцию в митохондриальной мембране.

Н⁺-АТФаза встроена во внутреннюю мембрану митохондрий. Она похожа на гриб и состоит из двух белковых факторов F₀ и F₁ (рисунок 12). Фактор F₀ пронизывает всю толщу внутренней мембраны митохондрий. Шаровидная часть, выступающая в матрикс митохондрий, – это фактор F₁. Строение, свойства и функции этих белковых факторов совершенно разные.

Фактор F₀ состоит из трех типов полипептидных цепей. Этот фактор выполняет функцию протонпроводящего канала, по которому протоны водорода попадают к фактору F₁ (рисунок 12).

Фактор F₁ является водорастворимой частью Н⁺-АТФазы и представляет собой белковый комплекс, состоящий из девяти субъединиц пяти разных типов. Одна эпимолекула фактора F₁ содержит 3α, 3β и по одной субъединице γ, δ, ε (α₃β₃γδε). Фактор F₁ осуществляет синтез АТФ из АДФ и фосфорной кислоты. Центры связывания АДФ и АТФ находятся в субъединицах α и β, каждая из которых может удерживать по одной молекуле АДФ или АТФ. Полагают, что каталитический центр, ускоряющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и Н₃Р0₄, находится на β-субъединице, а α-субъединица прикрывает его от воздействия ингредиентов митохондриального матрикса.

Существует несколько концепций, объясняющих механизм образования АТФ при посредстве Н⁺-АТФазы. Все концепции рассматривают протоны водорода, поступающие по протонпроводящему каналу к фактору F₁, в качестве активаторов различных процессов, приводящих к образованию АТФ из АДФ и фосфорной кислоты.

Одна из концепций сводится к предположению, что протоны, поступающие по протонпроводящему каналу F₀, активируют неорганический фосфат (Р_н), связанный активным центром β-субъединицы, отнимая от него ОН-группу (реакция элиминирования воды). Одновременно ОН-группа концевого фосфата АДФ, также присоединенного к активному центру β-субъединицы, теряет протон за счет взаимодействия с ОН-группой матрикса (где ОН^ˉ-группы накапливаются в результате переноса Н⁺ в межмембранное пространство) (рисунок 11). Активированные фосфат и АДФ соединяются и образуют АТФ (рисунок 13).

В мышечной клетке существует митохондриальный ретикулум, при помощи которого митохондрии связаны в единую цепь или представляют собой одну гигантскую разветвленную митохондрию. По ее энергизированной мембране электрохимический трансмембранный градиент протонов ΔµН⁺ может передаваться на большие расстояния, обеспечивая в нужном месте синтез необходимого количества АТФ для совершения мышечной работы.

2.1.6 Дыхательный контроль и нарушение клеточного дыхания

Дыхательный контроль – это регуляция скорости переноса электронов по дыхательной цепи отношением АТФ/АДФ. Чем меньше это отношение (преобладает АДФ), тем интенсивнее идет дыхание (это обеспечивает реакцию АДФ + Н₃РО₄ → АТФ).

Ингибиторы дыхания – вещества, прекращающие поток электронов по цепи переноса электронов (дыхательной цепи ферментов):

1. Ингибиторы транспорта электронов от НАДН к коферменту Q: ротенон (инсектицид), барбитураты (амобарбитал, секобарбитал), пирицидин (антибиотик). Предотвращают генерирование протонного градиента в комплексе I. В то же время указанные ингибиторы не нарушают окисление сукцината.
2. Антимицин А тормозит поток электронов от KoQ к цитохрому с, предотвращая синтез АТФ, сопряженный с генерированием протонного градиента в комплексе III. Этот блок можно обойти добавлением аскорбиновой кислоты, которая непосредственно восстанавливает цитохром с.
3. Транспорт электронов может быть блокирован между цитохромоксидазным комплексом и кислородом под действием CN⁻, N₃⁻ и СО. В присутствии этих ингибиторов из-за прекращения тока электронов не происходит фосфорилирования, сопряженного с генерированием протонного градиента в комплексе IV.
4. Олигомицин и дициклогексилкарбодиимид (DCCD) предотвращают поток протонов через АТФ-синтазу.
5. АТФ-АДФ-транслоказа специфически ингибируется очень низкими концентрациями атрактилозида (растительный гликозид) или бонкрековой кислотой (антибиотик). Атрактилозид связывается с транслоказой на цитозольной поверхности мембраны, а бонкрековая кислота – на стороне матрикса. Блокада транслоказы ведет к остановке окислительного фосфорилирования.

Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования возникает при повышении проницаемости мембраны митохондрий для протонов в любом месте, а не только в канале АТФ-синтазы. При этом не создается электрохимический потенциал, и энергия окисления рассеивается в виде тепла. Так действуют ионофоры (2,4-динитрофенол, валиномицин и др.). Они переносят обратно протоны через мембрану, выравнивая градиенты pH и мембранного потенциала. Лекарственные препараты (аминобарбитал), продукты жизнедеятельности микроорганизмов, избыток тиреоидных гормонов (вызывают накопление ненасыщенных жирных кислот, являющихся ионофорами) и др. приводят к разобщению дыхания и фосфорилирования, обеспечивая гипертермию.

---